KIT ELISA de ARN bicatenario (ARNds)

Este kit es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) acoplado con un sistema de biotina-estreptavidina, para la medición cuantitativa de ARNbc con una longitud superior a 60 pares de bases (pb), independientemente de la secuencia.La placa ha sido recubierta previamente con anticuerpo anti-dsRNA.Se agrega dsRNA presente en la muestra y se une a los anticuerpos que recubren los pocillos.Y luego se agrega el anticuerpo anti-ARNds biotinilado y se une al ARNds en la muestra.Después del lavado, se añade HRP-estreptavidina y se une al anticuerpo anti-dsRNA biotinilado.Después de la incubación, la HRP-estreptavidina no unida se elimina por lavado.Luego se agrega la solución de sustrato TMB y HRP la cataliza para producir un producto de color azul que cambia a amarillo después de agregar la solución de parada ácida.La densidad del amarillo es proporcional a la cantidad objetivo de ARNbc capturada en la placa.La absorbancia se mide a 450 nm.

Solicitud

Este kit es para la medición cuantitativa de ARNbc residual.

Componentes del kit

Almacenamiento y estabilidad

1. Para el kit no utilizado: todo el kit se puede almacenar entre 2 y 8 ℃ durante su vida útil.Se debe evitar la luz intensa para la estabilidad del almacenamiento.

2. Para el kit usado: una vez abierta la microplaca, cubra los pocillos no utilizados con sellador de placas y regréselo a la bolsa de aluminio que contiene el paquete desecante, selle la bolsa de aluminio y regrésela a 2~8 ℃ tan pronto como sea posible después de su uso.Otros reactivos deben devolverse a 2~8 ℃ tan pronto como sea posible después de su uso.

Materiales necesarios pero no suministrados

1. Lector de microplacas con filtro de 450 ± 10 nm (mejor si puede detectar longitudes de onda de 450 y 650 nm).

2. Agitador de microplacas.

3. Puntas y tubos de centrífuga sin RNasa.

Diagrama de flujo de operación

Antes de que empieces

1. Lleve todos los componentes del kit y las muestras a temperatura ambiente (18-25 ℃) antes de usarlos.Si el kit no se va a utilizar en una sola vez, saque únicamente las tiras y los reactivos para el experimento actual y deje las tiras y los reactivos restantes en las condiciones requeridas.

2. Tampón de lavado: diluya 40 ml de tampón de lavado concentrado 20X con 760 ml de agua desionizada o destilada para preparar 800 ml de tampón de lavado 1X.

3. Estándar: centrifugar o centrifugar brevemente la solución madre antes de usarla.La concentración de cuatro estándares proporcionados es de 5 ng/μL.Para los estándares UTP y pUTP dsRNA, diluya la solución madre a 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0pg/μL con tampón STE para dibujar la curva estándar.Para los estándares de ARNbc N1-Me-pUTP, diluya la solución madre a 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0 pg/μL con tampón STE para dibujar la curva estándar.Para el estándar de ARNbc de 5-OMe-UTP, diluya la solución madre a 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0 pg/μL con tampón STE para dibujar la curva estándar.Recomendamos que los estándares se puedan diluir según las siguientes tablas:

4. Anticuerpo de detección biotinilado y solución de trabajo de HRP-estreptavidina: centrifugue o centrifugue brevemente la solución madre antes de usarla.Diluirlos a la concentración de trabajo con tampón de dilución.

5. Subestado TMB: aspirar la dosis necesaria de la solución con puntas esterilizadas y no verter la solución residual nuevamente en el vial.El sustrato TMB es sensible a la luz, no exponga el sustrato TMB a la luz durante mucho tiempo.

Usando protocolo

1. Determine la cantidad de tiras necesarias para el ensayo.Inserte las tiras en los marcos para su uso.Las tiras de placa restantes que no se utilicen en este ensayo deben volver a empaquetarse en la bolsa con desecante.Cierre bien la bolsa para guardarlo refrigerado.

2. Agregue 100 μl de cada una de las diluciones de estándar, blanco y muestras en los pocillos correspondientes.Cubrir con el sellador de placas.Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente agitando a 500 rpm.Las muestras deben diluirse con tampón STE a la concentración adecuada para un ensayo preciso.

3. Paso de lavado: Aspire la solución y lave con 250 μl de tampón de lavado en cada pocillo y déjela reposar durante 30 segundos.Deseche completamente el tampón de lavado colocando la placa sobre papel absorbente.Lavar totalmente 4 veces.

4. Agregue 100 μl de solución de trabajo de anticuerpos de detección biotinilados en cada pocillo.Cubrir con el sellador de placas.Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente agitando a 500 rpm.

5. Repita el paso de lavado.

6. Agregue 100 μl de solución de trabajo de HRP-estreptavidina a cada pocillo.Cubrir con el sellador de placas.Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación a 500 rpm.

7. Repita el paso de lavado nuevamente.

8. Agregue 100 μl de solución de sustrato TMB a cada pocillo.Cubrir con el sellador de placas.Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Proteger de la luz.El líquido se volverá azul al agregar la solución de sustrato.

9. Agregue 50 μl de solución de parada en cada pocillo.El líquido se volverá amarillo al agregar la solución de parada.Luego ejecute el lector de microplacas y realice la medición a 450 nm inmediatamente.

Cálculo de resultados

1. Promedie las lecturas duplicadas para cada estándar, control y muestra y reste la densidad óptica estándar cero promedio.Construya una curva estándar con absorbancia en el eje vertical (Y) y concentración de ARNbc en el eje horizontal (X).

2. Se recomienda realizar el cálculo con un software de ajuste de curvas basado en computadora, como Curve Expert 1.3 o ELISA Calc en un modelo de ajuste no lineal de 5 o 4 parámetros.

Actuación

1. Sensibilidad:

límite inferior de detección: ≤ 0,001 pg/μL (para UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (para 5-OMe-UTP-dsRNA).

límite inferior de cuantificación: 0,0156 pg/μL (para UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (para N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (para 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Precisión: CV del intraensayo ≤10%, CV del interensayo ≤10%

3. Recuperación: 80%~120%

4. Linealidad: 0,0156-0,5 pg/μL (para UTP-, pUTP-dsRNA) 0,0312-1 pg/μL (para N1-Me-pUTP dsRNA), 0,0625-1 pg/μL (para 5-OMe-UTP-dsRNA).

Consideraciones

1. La temperatura y el tiempo de reacción de TMB son críticos; contrólelos estrictamente de acuerdo con las instrucciones.

2. Para lograr una buena reproducibilidad y sensibilidad del ensayo, es esencial lavar adecuadamente las placas para eliminar el exceso de reactivos que no reaccionaron.

3. Todos los reactivos deben mezclarse completamente antes de su uso y evitar errores durante la adición de muestras o reactivos.

4. Si se han formado cristales en el tampón de lavado concentrado (20x), caliente a 37 ℃ y mezcle suavemente hasta que los cristales se disuelvan por completo.

5. Evite el análisis de muestras que contengan azida sódica (NaN3), ya que podría destruir la actividad HRP y dar como resultado una subestimación de la cantidad de ARNbc.

6. Evite la contaminación por ARNasa durante el ensayo.

7. El estándar/muestra, el anticuerpo de detección y SA-HRP también se pueden realizar a temperatura ambiente sin agitación, pero esto puede provocar una disminución de la sensibilidad de detección de una vez.Para este caso, recomendamos que los estándares de ARNbc UTP y pUTP se diluyan a partir de 2 pg/μL, los estándares de ARNbc N1-Me-pUTP se deben diluir a partir de 4 pg/μL y el estándar de ARNbc 5-OMe-UTP se debe diluir a partir de 8 pg/μL.Además, se incuba la solución de trabajo de HRP-estreptavidina durante 60 minutos a temperatura ambiente.No utilice el agitador de matraces, ya que puede producir resultados inexactos.

Resultado típico

1. Datos de la curva estándar

2. Cálculo de la curva estándar

3. Rango de detección del revestimiento: 0,0312- 1 pg/μL