ARNm Cap2'-O-Metiltransferasa

El ARNm Cap 2´-O-metiltransferasa se derivó de una cepa recombinante de E. coli que porta el gen del ARNm Cap 2´-O-metiltransferasa de vaccinia.Esta enzima agrega un grupo metilo en la posición 2'-O del primer nucleótido adyacente a la estructura de la tapa en el extremo 5' del ARN. La enzima utiliza S-adenosilmetionina (SAM) como donante de metilo para metilar el ARN tapado (tapa -0) dando como resultado una estructura cap- 1.

La estructura Cap1 puede aumentar la eficiencia de la traducción, mejorando la expresión del ARNm en experimentos de transfección y microinyección. Esta enzima requiere específicamente ARN con una tapa m7GpppN como sustrato.No puede utilizar ARN con pN, ppN, pppN o GpppN en el extremo 5'.El ARN protegido se puede preparar mediante transcripción in vitro utilizando un análogo de protección o mediante protección enzimática utilizando la enzima limitadora de Vaccinia.

Componentes

ARNm Cap 2´-O-Metiltransferasa (50U/μL)

10 × tampón de reacción de limitación

Almacenamiento

-25 ～- 15 ℃ para almacenamiento (evite ciclos repetidos de congelación y descongelación)

Búfer de almacenamiento

Tris-HCl 20 mM (pH 8,0, 25 ℃), NaCl 100 mM, DTT 1 mM, EDTA 0, 1 mM, Triton X-100 al 0, 1%, glicerol al 50%.

Definición de unidad

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para metilar 10 pmoles de un transcrito de ARN protegido de 80 nt en 1 hora a 37°C.

Ensayos de control de calidad.

exonucleasa:50 U de ARNm Cap 2 ´ -O-Metiltransferasa con 1 μg de ADN digerido con λ-Hind III a 37 ℃ durante 16 horas no produce degradación, según lo determinado mediante electroforesis en gel de agarosa.

endonucleasa: 50 U de ARNm Cap 2 ´ -O-Metiltransferasa con 1 μg de λADN a 37 ℃ durante 16 horas no producen degradación, según lo determinado mediante electroforesis en gel de agarosa.

Nickase: 50 U de ARNm Cap 2 ´ -O-Metiltransferasa con 1 μg de pBR322 a 37 ℃ durante 16 horas no producen degradación, según lo determinado mediante electroforesis en gel de agarosa.

ARNasa: 50 U de ARNm Cap 2 ´ -O-Metiltransferasa con 1,6 μg de ARN MS2 durante 4 horas a 37 ℃ no producen degradación, según lo determinado mediante electroforesis en gel de agarosa.

E. coli ADN: Se analizan 50 U de ARNm Cap 2 ´ -O-Metiltransferasa para detectar la presencia deE. coli ADN genómico utilizando TaqMan qPCR con cebadores específicos para elE. coli Locus de ARNr 16S.ElE. coli La contaminación del ADN genómico es =1.E. coli genoma.

Bacteriano endotoxina: Prueba LAL, según la Farmacopea China IV edición 2020, método de prueba de límite de gel, regla general (1143).El contenido de endotoxinas bacterianas debe ser = 10 UE/mg.

Sistema de reacción y condiciones.

1. Combine una cantidad adecuada de ARN tapado y H2O libre de ARNasa en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml hasta un volumen final de 16,0 µL.

2. Calentar a 65 ℃ durante 5 minutos seguido de un baño de hielo durante 5 minutos.

3. Agregue los siguientes componentes en el orden especificado (para la metilación del ARN protegido

menos de 10

*10× Tampón de reacción de limitación: Tris-HCl 500 mM (pH 8,0, 25 ℃), KCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM.

4. Incubar a 37 ℃ durante 1 hora (se recomiendan 2 horas de incubación para el fragmento objetivo de menos de 200 nt).

Aplicaciones

Mejorar la expresión de ARNm durante experimentos de microinyección y transfección.

Notas de uso

1. Antes de la reacción, el ARN debe purificarse y disolverse en agua libre de nucleasas; todas las soluciones no deben contener EDTA ni iones.

2. Se recomienda calentar la muestra de ARN a 65 ℃ durante 5 minutos antes de la reacción para eliminar la estructura secundaria en el extremo 5' del transcrito.Podría ampliarse a 10 min para una estructura compleja de 5 ´-terminales.