PNGasa F
La péptido-N-glucosidasa F (PNGasa F) es el método enzimático más eficaz para eliminar casi todos los oligosacáridos unidos a N de las glicoproteínas.La PNGasa F es una amidasa que escinde entre los residuos más internos de GlcNAc y asparagina de oligosacáridos complejos, híbridos y con alto contenido de manosa de glicoproteínas unidas a N.
Solicitud
Esta enzima es útil para eliminar los residuos de carbohidratos de las proteínas.
Preparación y especificación
| Apariencia | Líquido incoloro |
| Pureza de proteínas | ≥95% (de SDS-PAGE) |
| Actividad | ≥500.000 U/mL |
| exoglicosidasa | No se pudo detectar actividad (ND) |
| Endoglicosidasa F1 | ND |
| Endoglicosidasa F2 | ND |
| Endoglicosidasa F3 | ND |
| Endoglicosidasa H | ND |
| proteasa | ND |
Propiedades
| número CE | 3.5.1.52(Recombinante de microorganismo) |
| Peso molecular | 35 kDa (PÁGINA SDS) |
| Punto isoeléctrico | 8. 14 |
| pH óptimo | 7.0-8.0 |
| Temperatura óptima | 65ºC |
| Especificidad del sustrato | Escisión de enlaces glicosídicos entre GlcNAc y residuos de asparagina Fig.1 |
| Sitios de reconocimiento | Glicanos unidos a N a menos que contengan fucosa α1-3 Fig. 2 |
| Activadores | TDT |
| inhibidor | Ficha de datos de seguridad (MSDS) |
| Temperatura de almacenamiento | -25 ~-15℃ |
| Inactivación por calor | Una mezcla de reacción de 20 µl que contiene 1 µl de PNGasa F se inactiva mediante incubación a 75 °C durante 10 minutos. |
Fig. 1 Especificidad de sustrato de PNGasa F
Fig. 2 Situaciones de reconocimiento de PNGasa F.
Cuando los residuos internos de GlcNAc están unidos a la fucosa α1-3, la PNGasa F no puede escindir los oligosacáridos unidos a N de las glicoproteínas.Esta modificación es común en plantas y en algunas glicoproteínas de insectos.
Coponentes
|
| Componentes | Concentración |
| 1 | PNGasa F | 50 µl |
| 2 | 10 × tampón desnaturalizante de glicoproteína | 1000 µl |
| 3 | 10×GlicoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Definición de unidad
Una unidad (U) se define como la cantidad de enzima necesaria para eliminar >95 % de los carbohidratos de 10 µg de RNasa B desnaturalizada en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 µL.
Condiciones de reacción
1. Disuelva 1-20 µg de glicoproteína con agua desionizada, agregue 1 µl de tampón desnaturalizante de glicoproteína 10× y H2O (si es necesario) para obtener un volumen de reacción total de 10 µl.
2.Incubar a 100°C durante 10 min, enfriar en hielo.
3.Añadir 2 µl de 10×GlycoBuffer 2, 2 µl de NP-40 al 10 % y mezclar.
4.Añadir 1-2 µl de PNGasa F y H2O (si es necesario) para obtener un volumen de reacción total de 20 µl y mezclar.
5.Incubar la reacción a 37°C durante 60 min.
6.Para análisis SDS-PAGE o análisis HPLC.
