Enzima limitadora del virus vaccinia
La enzima bloqueadora del virus Vaccinia se deriva de una cepa recombinante de E. coli que porta los genes de la enzima bloqueadora de Vaccinia.Esta única enzima está compuesta por dos subunidades (D1 y D12) y tiene tres actividades enzimáticas (ARN trifosfatasa y guanililtransferasa por la subunidad D1 y guanina metiltransferasa por la subunidad D12).La enzima capping del virus vaccinia es eficaz para catalizar la formación de la estructura de la caperuza, que puede unir específicamente la estructura de la caperuza de 7-metilguanilato (m7Gppp, Cap 0) al extremo 5' del ARN.La estructura de la tapa (Cap 0) juega un papel importante en la estabilización, el transporte y la traducción del ARNm en eucariotas.La protección del ARN mediante reacción enzimática es un método eficaz y sencillo que puede mejorar significativamente la estabilidad y la traducción del ARN para la transcripción, transfección y microinyección in vitro.
Componentes
Enzima bloqueadora del virus vaccinia (10 U/μL)
10 × tampón de limitación
Condiciones de almacenaje
-25～- 15℃ para almacenamiento (Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación)
Búfer de almacenamiento
Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM,
TDT 1 mM, EDTA 0, 1 mM, Triton X-100 al 0, 1%, glicerol al 50%.
Definición de unidad
Una unidad de enzima limitadora del virus vaccinia se define como la cantidad de enzima necesaria para incorporar 10 pmol de GTP en un transcrito de 80 nt en 1 hora a 37 °C.
Control de calidad
Exonucleasa:10 U de enzima de protección del virus Vaccinia con 1 μg de ADN digerido con λ-Hind III a 37 ℃ durante 16 horas no producen degradación, según lo determinado mediante electroforesis en gel de agarosa.
Endonucleasa:10 U de enzima bloqueadora del virus vaccinia con 1 μg de λDNA a 37 ℃ durante 16 horas no producen degradación, según lo determinado por electroforesis en gel de agarosa.
Nickase:10 U de enzima bloqueadora del virus vaccinia con 1 μg de pBR322 a 37 ℃ durante 16 horas no producen degradación, según lo determinado por electroforesis en gel de agarosa.
ARNasa:10 U de enzima bloqueadora del virus vaccinia con 1,6 μg de ARN MS2 durante 4 horas a 37 ℃ no producen degradación, según lo determinado mediante electroforesis en gel de agarosa.
1.ADN de coli:Se analizan 10 U de enzima limitadora del virus Vaccinia para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli utilizando TaqMan qPCR con cebadores específicos para el locus de ARNr 16S de E. coli.La contaminación del ADN genómico de E. coli es ≤1 genoma de E. coli.
2.Bacteriano Endotoxina: Prueba LAL, según la Farmacopea China IV edición 2020, método de prueba de límite de gel, regla general (1143).El contenido de endotoxinas bacterianas debe ser ≤10 UE/mg.
Sistema de reacción y condiciones.
1. Protocolo de limitación (volumen de reacción: 20 l)
Este procedimiento es aplicable a la reacción de protección de 10 μg de ARN (≥100 nt) y puede ampliarse según las demandas experimentales.
I) Combine 10 μg de ARN y H2O libre de nucleasas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml hasta un volumen final de 15,0 μl.*10×Tampón de protección: Tris-HCl 0,5 M, KCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, (25 ℃, pH 8,0)
2) Calentar a 65 ℃ durante 5 minutos y luego en un baño de hielo durante 5 minutos.
3) Agregue los siguientes componentes en el orden especificado
| Coponente | Vvolumen |
| ARN desnaturalizado (≤10μg, longitud≥100 nt) | 15 µL |
| 10×Tampón de limitación* | 2 µL |
| GTP (10 mm) | 1 µL |
| SAM (2 mm) | 1 µL |
| Enzima limitadora del virus vaccinia (10U/μL) | 1 µL |
*10×Tampón de protección: Tris-HCl 0,5 M, KCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, (25 ℃, pH 8,0)
4) Incubar a 37 °C durante 30 minutos; el ARN ahora está tapado y listo para aplicaciones posteriores.
2. Terminal de 5′ reacción de etiquetado (volumen de reacción: 20 µL)
Este protocolo está diseñado para marcar ARN que contiene un trifosfato 5' y puede ampliarse según las demandas.La eficiencia de la incorporación de etiquetas se verá afectada por la proporción molar de ARN: GTP, así como por el contenido de GTP en las muestras de ARN.
1) Combine la cantidad adecuada de ARN y H2O libre de nucleasas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml hasta un volumen final de 14,0 µL.
2) Calentar a 65 ℃ durante 5 minutos y luego en un baño de hielo durante 5 minutos.
3)Agregue los siguientes componentes en el orden especificado.
| Coponente | Vvolumen |
| ARN desnaturalizado | 14 µL |
| 10 × tampón de limitación | 2 µL |
| Mezcla GTP** | 2 µL |
| SAM (2 mm) | 1 µL |
| Enzima limitadora del virus vaccinia (10U/μL) | 1 µL |
** GTP MIX se refiere a GTP y una pequeña cantidad de marcadores.Para la concentración de GTP, consultea la Nota 3.
4) Incubar a 37 °C durante 30 minutos; el extremo 5' del ARN ahora está etiquetado y listo para el flujo posterior.
Aplicaciones
1. Tapar el ARNm antes de los ensayos de traducción/traducción in vitro
2. Etiquetado del extremo 5' del ARNm
Notas de uso
1.Calentar la solución de ARN antes de la incubación con la enzima bloqueadora de Vaccinia elimina la estructura secundaria en el extremo 5' del transcrito.Amplíe el tiempo a 60 minutos para transcripciones con finales de 5´conocidos y altamente estructurados.
2. El ARN utilizado para las reacciones de protección debe purificarse antes de su uso y suspenderse en agua libre de nucleasas.No debe haber EDTA presente y la solución debe estar libre de sales.
3. Para marcar el extremo 5', la concentración total de GTP debe ser alrededor de 1 a 3 veces la concentración molar de ARNm en la reacción.
4. El volumen del sistema de reacción se puede aumentar o reducir según el volumen real.
