Transcriptasa inversa M-MLV Neoscript
Neoscript Reverse Transcriptase es una transcriptasa inversa obtenida mediante detección de mutaciones del gen M-MLV del origen y expresión del virus de la leucemia murina de Moloney en E.coli.La enzima elimina la actividad de la RNasa H, tiene una mayor tolerancia a la temperatura y es adecuada para la transcripción inversa a alta temperatura.Por lo tanto, es útil para eliminar los efectos desfavorables de la estructura de alto nivel del ARN y los factores no específicos sobre la síntesis de ADNc, y tiene una mayor estabilidad y capacidad de síntesis de transcripción inversa.La enzima tiene mayor estabilidad y capacidad de síntesis de transcripción inversa.
Componentes
1.Transcriptasa inversa Neoscript de 200 U/μL
2.5 × búfer de primera cadena (opcional)
* 5 × First-Strand Buffer no contiene dNTP; agregue dNTP al preparar el sistema de reacción
Aplicación recomendada
1.QRT-PCR de un solo paso.
2.Detección de virus ARN.
Condición de almacenamiento
-20°C para almacenamiento a largo plazo, se debe mezclar bien antes de su uso, evitar la congelación y descongelación frecuente.
Definición de unidad
Una unidad incorpora 1 nmol de dTTP en 10 minutos a 37°C utilizando poli(A)•oligo(dT)25como plantilla/imprimación.
Control de calidad
1.Pureza electroforética SDS-PAGE superior al 98%.
2.Sensibilidad de amplificación, control lote a lote, estabilidad.
3.Sin actividad de nucleasa exógena, sin endonucleasa exógena o contaminación por exonucleasa
Configuración de reacción para la solución de la primera reacción en cadena
1.Preparación de la mezcla de reacción.
| Componentes | Volumen |
| oligo(dT)12-18 Cebador o cartilla aleatoriaa O cebadores específicos de genesb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| dNTP de 10 mm | 1 µL |
| Plantilla de ARN | ARN total≤ 5μg;ARNm≤ 1 μg |
| dH libre de ARNasa2O | A 10 µL |
Notas:a/b: seleccione diferentes tipos de cebadores según sus necesidades experimentales.
2.Calentar a 65°C durante 5 minutos y enfriar rápidamente en hielo durante 2 minutos.
3.Agregue los siguientes componentes al sistema anterior hasta un volumen total de 20 µL y mezcle suavemente:
| Componentes | Volumen (µL) |
| 5 × búfer de primera cadena | 4 |
| Transcriptasa inversa Neoscript (200 U/μL) | 1 |
| Inhibidor de RNasa (40 U/μL) | 1 |
| dH libre de ARNasa2O | A 20 µL |
4.Realice la reacción de acuerdo con las siguientes condiciones:
(1) Si se utiliza Random Primer, la reacción debe llevarse a cabo a 25 ℃ durante 10 minutos y luego a 50 ℃ durante 30 ~ 60 minutos;
(2) Si se utilizan Oligo dT o cebadores específicos, la reacción debe llevarse a cabo a 50 ℃ durante 30 ~ 60 minutos.
5.Calentar a 95 ℃ durante 5 minutos para inactivar la transcriptasa inversa Neoscript y finalizar la reacción.
6.Los productos de transcripción inversa se pueden utilizar directamente en la reacción de PCR y en la reacción de PCR cuantitativa de fluorescencia, o se pueden almacenar a -20 ℃ durante mucho tiempo.
PCR-Rreacción:
1.Preparación de la mezcla de reacción.
| Componentes | Concentración |
| 10 × tampón de PCR (sin dNTP, sin Mg²+) | 1× |
| dNTP (10 mm cada dNTP) | 200 µM |
| MgCl 25 mM2 | 1-4 mm |
| Taq ADN polimerasa (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Cebador 1 (10 μM) | 0,2-1 µM |
| Cebador 2 (10 μM) | 0,2-1 µM |
| Plantillaa | ≤10% Solución de primera reacción en cadena (2 μL) |
| ddH2O | A 50 µL |
Notas:a: Si se agrega demasiada solución de primera reacción en cadena, la reacción de PCR puede inhibirse.
2.Procedimiento de reacción de PCR
| Paso | Temperatura | Tiempo | Ciclos |
| Predesnaturalización | 95 ℃ | 2-5 minutos | 1 |
| Desnaturalización | 95 ℃ | 10-20 segundos | 30-40 |
| Recocido | 50-60 ℃ | 10-30 segundos | |
| Extensión | 72 ℃ | 10-60 segundos |
Notas
1.Adecuado para la optimización de la temperatura de transcripción inversa en el rango de 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Tiene mejor estabilidad y es adecuado para la amplificación por transcripción inversa a alta temperatura.Además, es favorable para atravesar eficientemente regiones estructurales complejas de ARN.También esoes adecuado para la detección por RT-PCR cuantitativa de fluorescencia múltiple de un solo paso.
3.Buena compatibilidad con varias enzimas de amplificación por PCR y es adecuado para reacciones RT-PCR de alta sensibilidad.
4.Adecuado para la reacción de RT-PCR cuantitativa de fluorescencia de un solo paso de alta sensibilidad, mejora eficazmente la tasa de detección de bajas concentraciones de plantillas.
5.Adecuado para la construcción de bibliotecas de ADNc.
