Transcriptasa inversa M-MLV
La transcriptasa inversa RevScript se obtiene mediante tecnología de ingeniería genética.Tiene mayor capacidad de síntesis de ADNc, estabilidad térmica y límite de temperatura de reacción (hasta 60 °C).El producto de ADNc sintetizado tiene hasta 10 kb.Mejora la afinidad de las plantillas y es adecuado para la transcripción inversa de plantillas de ARN con estructura secundaria compleja o genes con pocas copias.
Componentes
| Componente | HC2003B (10.000U) | HC2003B (5*10.000U) | HC2003B (200.000U) |
| Transcriptasa inversa RevScript (200U/μL) | 50 µL | 5×50 µL | 1 mililitro |
| 5 × Búfer RevScript | 250 µL | 1,25 mililitros | 5ml |
Condición de almacenamiento
Este producto debe almacenarse a -25°C~-15°C durante 2 años.
Definición de unidad
Una unidad incorpora 1 nmol de dTTP en material insoluble en ácido en 10 minutos a 37 °C utilizando Oligo(dT) como cebadores.
Configuración de reacción
1.Desnaturalización del molde de ARN (este paso es opcional; la desnaturalización del molde de ARN ayuda a abrir las estructuras secundarias, lo que mejorará el rendimiento del ADNc de la primera cadena).
| Componentes | Volumen (µL) |
| ddH libre de ARNasa2O | a 13 |
| oligo(dT)18 (50 µmol/L) o cebador aleatorio (50 μmol/l) O cebadores específicos de genes (2 μmol/L) | 1 |
| o 1 | |
| o 1 | |
| plantilla de ARN | X a |
Notas:
1) a: ARN total: 1-5 ug o ARNm: 1-500 ng
2) Incubar a 65°C durante 5 minutos, luego transferir a hielo inmediatamente para enfriar durante 2 minutos.Breve centrifugación para recoger el líquido de reacción, agregue la solución de reacción de transcripción inversa como se muestra en la siguiente tabla.Pipetee suavemente para mezclar.
1.Preparación de la mezcla de reacción (volumen de 20 μL)
| Componentes | Volumen (µL) |
| Mezcla del paso anterior | 13 |
| 5 × búfer | 4 |
| Mezcla de dNTP (10 nmol/L) | 1 |
| Transcriptasa inversa (200 U/μL) | 1 |
| Inhibidor de RNasa (40 U/μL) | 1 |
1.Realice la reacción en las siguientes condiciones:
| Temperatura (°C) | Tiempo |
| 25ºCa | 5 minutos |
| 42ºCb | 15-30 minutos |
| 85ºCc | 5 minutos |
Notas:
1) a.Solo se requiere incubar a 25 °C durante 5 minutos para utilizar hexámeros aleatorios.Omita este paso cuando utilice Oligo (dT)18o cebador específico de gen.
2) b.La temperatura de transcripción inversa recomendada es 42 °C. Para plantillas con estructuras secundarias complicadas o alto contenido de GC, se recomienda elevar la temperatura de reacción a 50-55 °C.
3) c.Calentar a 85 ° C durante 5 minutos para inactivar la transcriptasa inversa.
4) El producto puede usarse directamente en reacciones de PCR o qPCR, o almacenarse a -20 °C para almacenamiento a corto plazo.Se recomienda aliguot los productos y almacenar a -80°C para un almacenamiento prolongado.Evite las frecuentes heladas y descongelaciones.
5) El producto es adecuado para RT-qPCR de un solo paso; se recomienda agregar de 10 a 20 U de transcriptasa inversa por cada 25 μl del sistema de reacción o aumentar gradualmente la cantidad de transcriptasa inversa según la situación real.
Notas
1.Mantenga limpia el área experimental;Se deben usar guantes y máscaras limpios durante la operación.Todos los consumibles utilizados en el experimento deben estar libres de RNasa para evitar la contaminación por RNasa.
2.Todos los procedimientos deben realizarse en hielo para evitar la degradación del ARN.
3.Se recomiendan muestras de ARN de alta calidad para garantizar una alta eficiencia de la transcripción inversa.
4.Este producto es sólo para uso en investigación.
5.Por favor opere con batas de laboratorio y guantes desechables, para su seguridad.
