Mini kit de extracción de ADN
Este kit adopta un sistema de tampón optimizado y una tecnología de purificación en columna de gel de sílice, que puede recuperar fragmentos de ADN de 70 pb a 20 kb de diversas concentraciones de gel de agarosa TAE o TBE.La columna de adsorción de ADN puede adsorber especialmente ADN en condiciones de alto contenido de sal.Además, el kit puede purificar directamente fragmentos de ADN de productos de PCR, sistemas de reacción enzimática o productos de ADN crudo obtenidos por otros métodos, y eliminar impurezas como proteínas, otros compuestos orgánicos, iones de sales inorgánicas y cebadores oligonucleotídicos.Puede garantizar que la purificación se pueda completar en 10-15 minutos.El ADN purificado se puede utilizar directamente para ligación, transformación, digestión enzimática, transcripción in vitro, PCR, secuenciación, microinyección, etc.
Condiciones de almacenaje
Almacenar a -15 ~ -25 ℃ y transportar a temperatura ambiente.
Componentes
| Componentes | (100 rxns) |
| PIB amortiguador | 80ml |
| Búfer GW | 2 × 20ml |
| Tampón de elución | 20ml |
| Minicolumnas FastPure DNA G | 100 |
PIB de reserva:Tampón de unión al ADN.
Búfer GW:Tampón de lavado;agregue etanol absoluto en el volumen indicado en la botella antes de su uso.
Tampón de elución:Elución.
Minicolumnas FastPure DNA-G:Columnas de adsorción de ADN.
Tubos de recogida 2 ml:Tubos de recogida de filtrado.
Materiales preparados
Tubos esterilizados de 1,5 ml, etanol absoluto e isopropanol (cuando el fragmento de ADN sea ≤100 pb, agregar 1 volumen
isopropanol a 1 volumen de gel), baño de agua.
Proceso de experimento
Agregue 80 ml de etanol para diluir el tampón GW como se indica en la etiqueta antes de su uso y guárdelo a temperatura ambiente.
Mecanismo
1. Solución de reacción de PCR
Esquema de extracción en gel: agregue un volumen igual al esquema de recuperación de la solución de reacción de PCR de buffer GDP:Agregue 5 veces el volumen de Buffer
2. PIB Calcule el volumen de gel (100 μl equivale a 100 mg)
disolver gel
3. Precalentar a 50 ~ 55℃
4. Lavado de enlace
Agregue 300 μL de tampón GDP*
Añadir 700 μL de tampón GW
Añadir 700 μL de tampón GW
5. eluir
Agregue de 20 a 30 μl de tampón de elución o agua desionizada.
Notas* Recuperación del fluido de reacción de PCR sin este paso
Programa de extracción de gel
1. Después de la electroforesis de ADN para fraccionar fragmentos de ADN, corte la única franja del fragmento de ADN del gel de agarosa bajo luz ultravioleta.Se recomienda utilizar papel absorbente para absorber la humedad aparente del gel y minimizar el tamaño de la porción de gel eliminando el exceso de agarosa posible.Pese la rebanada de gel (sin tubo de microcentrífuga) para calcular su volumen: el volumen de 100 mg de rebanada de gel es de aproximadamente 100 l, asumiendo que la densidad es de 1 g/ml.
2. Agregue un volumen igual de tampón GDP, incube a 50 ~ 55 ℃ durante 7-10 minutos (de acuerdo con el tamaño del gel, ajuste el tiempo de incubación hasta que el gel se disuelva por completo).Invertir el tubo 2 veces durante la incubación.
Δ La adición de 1 a 3 volúmenes de buffer GDP no influirá en la eficiencia de la recuperación del ADN.Si el fragmento de ADN que se va a recuperar tiene <100 pb, se deben agregar 3 volúmenes de tampón GDP;cuando la porción de gel se haya disuelto por completo, agregue 1 volumen de isopropanol y mezcle bien, luego continúe con el siguiente paso.
3. Centrifugue brevemente para llevar la muestra al fondo del tubo, inserte las minicolumnas FastPure DNA G en los tubos de recolección de 2 ml, transfiera con cuidado la solución hasta un máximo de 700 μl una vez al día.
tiempo a las columnas de filtración, centrifugar a 12.000 rpm (13.800 X g) durante 30-60 seg.
4. Desechar el filtrado y agregar 300 μL de Tampón GDP a la columna, incubar a temperatura ambiente durante 1 min, centrifugar a 12.000 rpm (13.800 X g) durante 30-60 seg.
5. Deseche el filtrado y agregue 700 μL de tampón GW (¡compruebe si se ha agregado etanol absoluto de antemano!) a la columna, centrifugue a 12 000 rpm (13 800 X g) durante 30 a 60 segundos.
Δ Agregue Buffer GW alrededor de la pared de la columna de adsorción, o agregue la cubierta posterior de Buffer GW y mezcle boca abajo de 2 a 3 veces para ayudar a eliminar completamente la sal adherida a la pared del tubo.
6. Repita el paso 5.
Δ El lavado con Buffer GW dos veces puede garantizar que la sal se elimine por completo y eliminar el impacto en experimentos posteriores.
7. Deseche el filtrado y centrifugue la columna vacía a 12.000 rpm (13.800 X g) durante 2 min.
8. Inserte la columna en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml, agregue de 20 a 30 µl de tampón de elución al centro de la membrana de la columna, incube durante 2 minutos y luego centrifugue a 12 000 rpm (13 800 x g) durante 1 minuto.Deseche la columna, almacene el ADN obtenido a -20ºC.
Δ Transferir el sobrenadante del paso 8 a la columna para eluir nuevamente y precalentar el tampón de elución a 55ºC (cuando el fragmento de ADN >3 kb) puede ser útil para aumentar la eficiencia de recuperación.
Programa de recuperación de productos de PCR
Este protocolo es aplicable para purificar fragmentos de ADN de productos de PCR, sistemas de reacción enzimática y otros productos de ADN crudo (incluido el ADN genético).Esta solución puede eliminar eficazmente varios nucleótidos, cebadores, dímeros de cebadores, moléculas de sal, enzimas y otras impurezas.
1. Centrifugue brevemente los productos de PCR, la solución de reacción enzimática y otros productos crudos de ADN.Estime su volumen con una pipeta y transfiéralo a un tubo esterilizado de 1,5 ml o 2 ml.Agregue ddH2O hasta que el volumen sea de 100 μL;mientras que para el ADN genómico con alta concentración, diluir a 300 μL con ddH2O ayudará a mejorar la eficiencia de la recuperación.
2. Agregue 5 volúmenes de Buffer GDP y mezcle bien mediante inversión o agitación vorticial.Si el fragmento de ADN de interés >100 pb, se deben agregar 1,5 volúmenes adicionales (muestras + tampón GDP) de etanol.
3. Inserte la columna nuevamente en el tubo de recolección, transfiera la mezcla a la columna, centrifugue a 12 000 rpm (13 800 × g) durante 30 a 60 segundos.Si el volumen de la solución mezclada es >700 µL, vuelva a colocar la columna de adsorción en el tubo de recolección, transfiera la solución restante a la columna de adsorción y centrifugue a 12 000 rpm (13 800 × g) durante 30 a 60 segundos.
4. La siguiente actuación se refiere a los pasos 5 – 8 del programa de extracción 08-1/Gel.
Aplicaciones
Varias concentraciones de gel de agarosa TAE o TBE;Productos de PCR, sistemas de reacción enzimática u otros productos de ADN crudo obtenidos por diversos métodos.Los fragmentos recuperados van desde70 pb -20 kb.
Notas
Sólo para uso en investigación.No debe utilizarse en los procedimientos de diagnóstico.
1. Agregue 80 ml de etanol para diluir el tampón GW como se indica en la etiqueta antes de su uso y guárdelo a temperatura ambiente.
2. Si el tampón GDP es fácil de precipitar durante el almacenamiento a baja temperatura, se puede colocar a temperatura ambiente durante un período de tiempo antes de su uso.Si es necesario, se puede precalentar en un baño de agua a 37 ℃ hasta que el precipitado se disuelva por completo y luego se puede utilizar después de mezclar.
3. Ajuste de antemano la temperatura del baño de agua a 50 ~ 55 ℃.
4. En el paso 1 del programa de extracción de gel/08-1, minimizar el tamaño de la porción de gel reducirá significativamente el tiempo de disolución y aumentará la eficiencia de la recuperación (el ADN linealizado se hidroliza fácilmente cuando se expone continuamente a alta temperatura).No exponga el gel de ADN a los rayos UV durante mucho tiempo, ya que la luz ultravioleta puede dañar el ADN.
5. Disuelva completamente el gel en 08-1/paso 2 del programa de extracción de gel; de lo contrario, la eficiencia de recuperación de ADN se verá seriamente afectada.
6. Precaliente el tampón de elución o ddH2O a 55 ℃, lo cual es útil para mejorar la eficiencia de la elución del ADN.Se recomienda almacenar el ADN en eluyente de Tris-HCl 2,5 mM, pH 7,0 – 8,5.
