Kit maxi de plásmido EndoFree
Este kit es adecuado para la extracción de 150 a 300 ml de solución bacteriana cultivada durante la noche, utilizando un método mejorado de lisis alcalina SDS para lisar las bacterias.El extracto crudo se combina selectivamente con un eliminador de endotoxinas único y se separa mediante centrifugación para eliminar las endotoxinas.Luego, la membrana de gel de sílice se une selectivamente al ADN plasmídico en la solución en condiciones de alto contenido de sal y bajo pH.A esto le sigue la adición de tampón de lavado para eliminar impurezas y otros componentes bacterianos.Finalmente, se utiliza un tampón de elución bajo en sal y alto pH para eluir el ADN plasmídico puro de la membrana de la matriz de silicio.La membrana de gel de sílice emplea una membrana de adsorción especial, y la diferencia en la cantidad de adsorción entre la columna y la columna es muy pequeña y la repetibilidad es buena.No se requieren fenol, cloroformo ni otros reactivos tóxicos, ni tampoco pasos de precipitación con etanol.Este kit se puede utilizar para extraer rápidamente entre 0,2 y 1,5 mg de ADN plasmídico puro con alto número de copias, con una tasa de extracción del 80% al 90%.El kit utiliza una fórmula de proceso única que elimina las endotoxinas, el contenido de endotoxinas es extremadamente bajo y el efecto de transfección celular es excelente.El plásmido extraído podría usarse directamente en digestión enzimática, PCR, transcripción in vitro, transformación, secuenciación y otros experimentos de biología molecular.
Condiciones de almacenaje
La RNasaA debe almacenarse a -30 ~ -15 ℃ y transportarse a ≤0 ℃.
Endotoxin Scavenger se puede almacenar a 2 ~ 8 ℃ durante un mes, y a -30 ~ -15 ℃ para almacenamiento a largo plazoy transportado a ≤0 ℃.
Otros componentes deben almacenarse a temperatura ambiente (15 ~ 25 ℃) y transportarse a temperatura ambiente.
Componentes
| Componentes | 10RXNS |
| ARNasa A | 750 µL |
| Búfer P1 | 75ml |
| Tampón P2 | 75ml |
| Tampón P4 | 75ml |
| Eliminador de endotoxinas | 25ml |
| PW del búfer | 2 × 22ml |
| TB tampón | 20ml |
| Columnas FastPure DNA Maxi (cada una en un tubo de recolección de 50 ml) | 10 |
| Tubo de recolección libre de endotoxinas | 2×5 |
ARNasaA:10 mg/ml, utilizado para eliminar el ARN.
Búfer P1:tampón de suspensión bacteriana, agregue RNaseA al tampón P1 antes del primer uso.
Tampón P2:tampón de lisis bacteriana (que contiene SDS/NaOH).
Tampón P4:tampón neutralizante.
Eliminador de endotoxinas:eliminar eficazmente la endotoxina del extracto crudo de plásmido.
PW del búfer:tampón de lavado, añadir el volumen estipulado de etanol antes del primer uso.
TB tampón:tampón de elución.
Maxicolumnas FastPure DNA:Columnas de adsorción de ADN plasmídico.
Tubos de recogida 50 ml:tubos de recogida de filtrado.
Tubo de recolección libre de endotoxinas:Tubos de recogida de ADN plasmídico.
Materiales preparados
Etanol absoluto, isopropanol, tubos de centrífuga de fondo redondo de 50 ml y libre de endotoxinas de 50 mltubos de centrífuga.
Aplicaciones
Este producto es adecuado para la extracción a gran escala de plásmidos de 150 a 300 ml de solución bacteriana.cultivado durante la noche.
Proceso de experimento
1. Tome 150 – 200 ml (no más de 300 ml) de solución bacteriana cultivada durante la noche y centrifugue aaproximadamente 11.000 rpm (12.000 × g) durante 1 – 2 min.Deseche el sobrenadante y recoja las bacterias.
Δ Cuando se recolectan más de 50 ml de solución bacteriana, las bacterias se pueden recolectar agregando solución bacteriana, centrifugación, desechando el sobrenadante y otros pasos en el mismo tubo de 50 ml para
varias veces.
2. Agregue 7,5 ml de tampón P1 (verifique si se ha agregado ARNasaA al tampón P1) a la centrífuga.tubo que contiene bacterias y mezclar bien mediante vórtex o pipeteo.
Δ La resuspensión completa de las bacterias en este paso es fundamental para el rendimiento y no debe haber grumos bacterianos después de la resuspensión.Si hay grupos bacterianos que no están completamente mezclados, afectará la lisis, lo que resultará en un bajo rendimiento y pureza.Si la DO600 de la solución bacteriana es 0,65, se recomienda utilizar 7,5 ml de tampón P1 al extraer de 150 ml de solución bacteriana;cuando la DO600 es 0,75, se deben utilizar 8 ml de tampón P1 y los volúmenes de los tampones P2 y P4 se deben cambiar en consecuencia.Si el volumen de la solución bacteriana se aumenta a 200 ml, se recomienda que elEl volumen de los tampones P1, P2 y P4 debe aumentarse proporcionalmente.
3. Agregue 7,5 ml de tampón P2 a la suspensión bacteriana del paso 2 y mezcle suavemente hacia arriba y hacia abajo durante 6 a 8 minutos.veces e incubar a temperatura ambiente durante 4 – 5 min.
Δ Invierta suavemente para mezclar bien.El vórtex provocará la fragmentación del ADN genómico, lo que dará como resultado fragmentos de ADN genómico en el plásmido extraído.En este momento, la solución se vuelve viscosa y translúcida, lo que demuestra que las bacterias han sido completamente lisadas.La duración no debe exceder los 5 min para evitar la destrucción de los plásmidos.Si la solución no es transparente, es posible que haya demasiadas bacterias, lo que provocarálisis incompleta, por lo que la cantidad de bacterias debe reducirse adecuadamente.
4. Agregue 7,5 ml de Tampón P4 a la suspensión bacteriana del paso 3 e invierta inmediatamente suavemente de 6 a 8 veces para permitir que la solución neutralice completamente el Tampón P2.En este momento debería aparecer un precipitado floculento de color blanco.Centrifugar a más de aproximadamente 11 000 rpm (12 000 × g) durante 10 a 15 minutos, pipetear con cuidado el sobrenadante en un nuevo tubo de centrífuga de fondo redondo de 50 ml (preparado por usted mismo) y evitaraspirar el precipitado blanco flotante.
Δ Agregue el tampón P4 e invierta inmediatamente para mezclar bien.Deje reposar el tubo hasta que el precipitado blanco se distribuya uniformemente por toda la solución para evitar la producción de precipitación local que podría afectar la neutralización.Si no hay un precipitado floculante blanco uniforme antes de la centrifugación y el sobrenadante no es claro después de la centrifugación, el tubo se puedeSe centrifugó durante otros 5 min.
5. Agregue 0,1 veces el volumen (10 % del volumen del sobrenadante, aproximadamente 2,2 ml) de Endotoxin Scavenger al sobrenadante del paso 4 e invierta para mezclar.Coloque la solución en un baño de hielo o insértela en hielo triturado (o en el refrigerador-congelador) durante 5 minutos hasta que la solución cambie de turbia a clara y transparente (o aúnligeramente turbio), y ocasionalmente mezclar varias veces.
Δ Después de agregar el eliminador de endotoxinas al sobrenadante, el sobrenadante se volverá turbio pero elEl sobrenadante debe volverse claro (o ligeramente turbio) después de enfriarlo en el baño de hielo.
6. Después de colocar el sobrenadante a temperatura ambiente (>25 ℃) durante 10 a 15 minutos, se volverá turbio a medida quesu temperatura aumenta hasta la temperatura ambiente.Luego se debe invertir el sobrenadante para mezclar.
Δ Si la temperatura ambiente es más baja o desea reducir el tiempo de extracción, el sobrenadante se puede incubar en un baño de agua a 37 ~ 42 ℃ durante 5 a 10 minutos y el siguiente paso se puede realizar después del sobrenadante.se vuelve turbio.
7. Centrifugue el sobrenadante a aproximadamente 11 000 rpm (12 000 × g) durante 10 minutos a temperatura ambiente (la temperatura debe ser >25 ℃) para separar la fase.La fase acuosa superior contiene el ADN, mientras que la capa inferior de la fase oleosa azul contiene endotoxinas y otras impurezas.Transfiere elfase acuosa que contiene ADN a un tubo nuevo ydeseche la capa aceitosa.
Δ La temperatura durante la centrifugación debe ser superior a 25 ℃ ya que la separación de fases efectiva noocurrir si la temperatura es demasiado baja.
Δ Si la separación de fases no es efectiva, la temperatura de centrifugación se puede ajustar a 30 ℃ yel tiempo de centrifugación se puede aumentar a 15 min.
Δ No chupes la capa aceitosa azul ya que contiene endotoxinas y otras impurezas.
Mecanismo
Neutralización por lisis por resuspensión
◇ Añadir 7,5 ml de tampón P1
◇ Añadir 7,5 ml de tampón P2
◇ Añadir 7,5 ml de tampón P4
eliminación de endotoxinas
◇Agregue 0, 1 veces el volumen sobrenadante de Endotoxin Scavenger
Encuadernación y lavado
◇ Agregue 0,5 veces el volumen de isopropanol.
◇ Añadir 10 ml de tampón PW
◇ Añadir 10 ml de tampón PW
elución
◇ Agregue 1 – 2 ml de tampón TB o ddH2O libre de endotoxinas.
