Kit de PCR directo a plantas

Número de gato: HCR2020A

El kit Plant Direct PCR es adecuado para la amplificación directa de hojas de plantas, semillas, etc., y puede usarse para la detección de alto rendimiento de muestras de plantas que no contienen polisacáridos ni polifenoles.La ADN polimerasa de amplificación directa basada en la evolución dirigida tiene una tolerancia superior a los inhibidores de la PCR en plantas.Mientras tanto, mantiene el alto rendimiento de amplificación, que es adecuado para la amplificación de fragmentos de ADN dentro de 5 kb.El exclusivo tampón de lisis A del kit se puede utilizar para lisar tejidos vegetales frescos o congelados.Es fácil de operar y el lisado se puede utilizar como plantilla para la amplificación sin purificación.El sistema contiene agentes protectores que permiten que las muestras crudas se amplifiquen eficazmente después de repetidas heladas y descongelaciones.2 × Plant Direct Master Mix solo necesita agregar cebadores y plantillas para realizar la reacción de amplificación, lo que reduce las operaciones de pipeteo y mejora el rendimiento de la detección y la reproducibilidad de los resultados.

Componentes

*El Plant Direct Lysis Buffer B es un reactivo opcional que se utiliza para neutralizar el Plant Direct Lysis Buffer A para prolongar el tiempo de almacenamiento de las muestras.Se puede utilizar según la situación real.

Condiciones de almacenaje

2 × Plant Direct Master Mix, almacenar a -30 ~ -15 ℃ y evitar la congelación y descongelación repetidas;Tampón de lisis directa de plantas, almacenar a -30 ~ -15 ℃ o 2 ~ 8 ℃.

Proceso de experimento

Procesamiento de muestras–hoja de planta

Método directo:Se recomienda utilizar hojas tiernas.Utilice una perforadora con un diámetro fijo de 0,5 a 3 mm para obtener una muestra pequeña y uniforme y luego agregue directamente la muestra al sistema de PCR (se recomienda un sistema de 50 μl).Tenga en cuenta que asegúrese de que la muestra esté en la solución de PCR y no contra la pared del tubo.Si se utiliza la PCR directa para amplificar fragmentos largos y muestras complejas, utilizar una muestra con un diámetro más pequeño (0,5 – 1 mm) como plantilla puede ayudar a obtener mejores resultados.

Método de lisis de molienda:Se recomienda utilizar hojas tiernas.Tome un pequeño trozo de hoja (aproximadamente 1 – 3 mm de diámetro), colóquelo en 20 μl de Plant Direct Lysis Buffer Ab y tritúrelo tanto como sea posible (este paso se puede realizar apretando la hoja con una punta de pipeta de 100 μl). para triturar la muestra).Si se utilizan volúmenes mayores de tejido foliar (no excedan los 7 mm), aumente el volumen de tampón de dilución a 50 µl.Después de moler las hojas, la solución debería verse verde.Después de una breve centrifugación, agregue 1 μl del sobrenadante al sistema de PCR como plantilla de reacciónc.

Método de lisis térmica:Se recomienda utilizar hojas tiernas.Tome un pequeño trozo de hoja (aproximadamente 1 – 3 mm de diámetro), colóquelo en 20 µl de tampón de lisis directa de plantas A y caliéntelo a 95 °C durante 5 a 10 minutos.El tiempo de lisis puede ampliarse adecuadamente para hojas difíciles de lisar (no más de 20 min).Si se utilizan volúmenes mayores de tejido foliar (no excedan los 7 mm), aumente el volumen de tampón de dilución a 50 µl.Después de calentar, centrifugue brevemente y agregue 1 μl de sobrenadante al sistema de PCR como plantilla de reacción.

Procesamiento de muestras–Semilla de planta

Método de lisis de molienda:Utilice un bisturí para cortar semillas con un diámetro de 5 mm, agréguelas a 100 l de tampón de lisis directa de plantas A y muela la muestra con una punta de pipeta u otras herramientas.Agite brevemente y deje reposar a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos.Asegúrese de que la muestra de semilla esté sumergida en el tampón de dilución.Después de una breve centrifugación, agregue 1 l del sobrenadante al sistema de PCR como plantilla de reacción.

Método de lisis térmica:Utilice un bisturí para cortar semillas con un diámetro de 5 mm, agréguelas a 100 l de tampón de lisis directa de plantas A y caliente a 95 °C durante 5 a 10 minutos.El tiempo de lisis puede ampliarse adecuadamente para hojas difíciles de lisar (no más de 30 min).Después de calentar, centrifugue brevemente y agregue 1 μl de sobrenadante al sistema de PCR como plantilla de reacción.

a.También se pueden utilizar tijeras u otras herramientas para cortar muestras de tamaño adecuado;Si se reutilizan el punzón o las tijeras, se deben limpiar con una solución de hipoclorito de sodio al 2% antes de cada uso para evitar la contaminación cruzada entre muestras.

b.Asegúrese de que el tampón de lisis Plant Direct esté completamente derretido antes de usarlo.Si el tampón es viscoso o tiene precipitados, se puede calentar a 37 ℃ para derretirlo por completo antes de usarlo.

C.El volumen de plantilla en el sistema de reacción se puede ajustar adecuadamente según la diferencia en el volumen de material vegetal y diluyente agregado.

Tampón de lisis directa de plantas

El tampón de lisis directa de plantas A contenido en este producto ha sido estrictamente optimizado para liberar el genoma de la mayoría de los tejidos vegetales y es adecuado para el almacenamiento a corto plazo de plantas crudas a 4 ℃.Si es necesario almacenar la muestra durante un período de tiempo más largo (p. ej., 1 a 2 meses), se recomienda transferir el sobrenadante a un tubo EP nuevo y almacenarlo a -20 ℃.Para almacenar las muestras de manera más estable, agregue un volumen igual de Plant Direct Lysis Buffer B al sobrenadante transferido, mezcle bien y almacene a -20 ℃.El tiempo de almacenamiento estable varía según las muestras y los estados de las plantas.

Sistema de reacción

a.contiene mg²⁺a una concentración final de 2 mM.

b.Se recomienda utilizar una concentración final de 0,4 μM para cada cebador.El uso excesivo de cebadores conducirá a una mayor amplificación inespecífica.

C.La cantidad de muestra utilizada se puede ajustar según la situación real.La cantidad utilizada en una única reacción de muestra cruda lisada se puede ajustar entre el 2% y el 20% del volumen total de la reacción.El uso de demasiadas muestras puede provocar fallos en la amplificación.

Programa de reacción

a.La desnaturalización inicial (98 ℃, 5 min) promueve la lisis del tejido vegetal, liberando ADN genómico que puede usarse para la amplificación por PCR.No acorte el tiempo ni disminuya la temperatura.

b.Se recomienda establecerlo igual al valor de Tm del cebador o 2 ~ 4 ℃ más alto que el valor de Tm.La ADN polimerasa de amplificación directa utilizada en este producto es diferente de la ADN polimerasa Taq convencional y tiene requisitos especiales para la temperatura de recocido de la reacción; el uso de una temperatura de recocido alta puede reducir eficazmente la amplificación no específica y mejorar la eficiencia de la amplificación.Para plantillas complejas, la amplificación eficiente se puede lograr ajustando la temperatura de recocido y prolongando el tiempo de extensión.

C.Si la longitud del producto de amplificación es ≤1 kb, el tiempo de extensión se establece en 30 segundos/kb;si la longitud del producto de amplificación es >1 kb, el tiempo de extensión se establece en 60 segundos/kb.

d.Para muestras complejas o muestras con bajo rendimiento de amplificación, el número de ciclos se puede aumentar adecuadamente a 40-50 ciclos.

Aplicaciones

Es aplicable para la amplificación directa de tejidos vegetales y la detección de alto rendimiento de muestras de plantas que no contienen polisacáridos ni polifenoles.

Notas

Sólo para uso en investigación.No debe utilizarse en los procedimientos de diagnóstico.

1. Para la amplificación de plantas crudas o la amplificación directa, se recomienda utilizar ADN genómico purificado como control positivo antes de comenzar el experimento para garantizar que el sistema, los cebadores y las operaciones sean correctos.

2. La ADN polimerasa de amplificación directa utilizada en este kit tiene una fuerte actividad correctora.Si es necesario realizar la clonación TA, se recomienda purificar el ADN antes de agregar la adenina.

3. Guía de diseño de imprimación:

a.Se recomienda que la última base en el extremo 3′ del cebador sea G o C.

b.Deben evitarse errores de coincidencia consecutivos en las últimas 8 bases en el extremo 3' del cebador.C.Evite las estructuras en horquilla en el extremo 3′ de la imprimación.

d.Las diferencias en el valor de Tm del cebador directo y del cebador inverso no deben ser superiores a 1 ℃ y el valor de Tm debe ajustarse a 60 ~ 72 ℃ (se recomienda Primer Premier 5 para calcular el valor de Tm).

mi.Las secuencias de cebadores adicionales que no coincidan con la plantilla no deben incluirse al calcular el valor de Tm del cebador.

F.Se recomienda que el contenido de GC de la imprimación sea del 40 % al 60 %.

gramo.La distribución global de A, G, C y T en el cebador debe ser lo más uniforme posible.Evite el uso de regiones con altos contenidos de GC o AT.

h.Evite la presencia de secuencias complementarias de 5 o más bases dentro del cebador o entre dos cebadores y evite la presencia de secuencias complementarias de 3 o más bases en el extremo 3' de dos cebadores.

i.Utilice la función NCBI BLAST para comprobar la especificidad del cebador y evitar una amplificación inespecífica.