2×Sensi Direct Premix-UNG (Sonda qPCR)
Número de gato: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) está diseñado para realizar PCR directamente a partir de muestras sin extracción de ADN ni preparación de muestras.Este reactivo consta de ADN polimerasa de arranque en caliente, uracilo ADN glicosilasa (UNG), inhibidor de ARNasa, MgCl.2, dNTP (con dUTP en lugar de dTTP) y estabilizadores para PCR cuantitativa (qPCR).Este reactivo presenta una alta tolerancia a los inhibidores y, por lo tanto, se puede aplicar directamente a la detección de muestras como hisopos de garganta, saliva, sangre entera anticoagulada, plasma y suero sin extracción de ADN.El reactivo utiliza un tampón patentado para qPCR con enzimas mixtas de ADN polimerasa antiinhibitoria y enzima UNG.Por lo tanto, puede obtener una buena amplificación de genes diana en muestras que contienen inhibidores e inhibir la amplificación de falsos positivos causada por residuos de PCR y contaminación por aerosoles.Este reactivo es compatible con la mayoría de los instrumentos de PCR cuantitativos fluorescentes, como Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche, etc.
Componentes
1. 50×Mezcla SensiDirect Enzima/UNG
2. 2 × tampón de premezcla SensiDirect (dUTP)
Condiciones de almacenaje
Todos los componentes deben mantenerse a -20 ℃ para almacenamiento a largo plazo y a 4 ℃ por hasta 3 meses.Mezcle bien después de descongelar y centrifugar antes de usar.Evite las frecuentes heladas y descongelaciones.
Protocolo de ciclismo
| Paso | Temperatura | Tiempo | Ciclo |
| Digestión | 50 ℃ | 2 minutos | 1 |
| Activación de la polimerasa | 95 ℃ | 1-5 minutos | 1 |
| Desnaturalizar | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 |
| Recocido/Extensión | 56-64℃ | 20-60 años |
Instrucciones de pipeteo
| Reactivo | Volumen por reacción | Volumen por reacción | Concentración final |
| 2×Búfer de premezcla SensiDirect (dUTP) | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| 50×Mezcla SensiDirect Enzima/UNG | 0,5 µL | 1 µL | 1× |
| 25×Mezcla de cebador y sonda1, 2 | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Muestra3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Volumen total | 25 µL | 50 µL | - |
1. La concentración final del cebador suele ser de 0,2 μM.Para obtener mejores resultados, la concentración del cebador se puede optimizar dentro del rango de 0,2 a 1 μM.
2. Generalmente, la concentración de la sonda se puede optimizar dentro del rango de 0,1-0,3 μM.La concentración óptima de la sonda está relacionada con el instrumento de amplificación por PCR en tiempo real, el tipo de sonda y el tipo de sustancia marcadora fluorescente.Consulte el manual del instrumento o los requisitos específicos de cada sonda fluorescente.
3. Los diferentes tipos de muestras contienen diferentes tipos y contenidos de inhibidor y número de copias del gen diana.El volumen de la muestra debe considerarse según la condición real.Haga una dilución de la muestra agregando agua libre de nucleasas o tampón TE, si es necesario.
4. Volumen recomendado de diferentes muestras:
| Muestra | Volumen para uno 50 µL reacción | Máximo relación |
| Sangre entera anticoagulada | 2,5 µL | 5% |
| Plasma | 15 µL | 30% |
| Suero | 10 µl | 20% |
| hisopo de garganta | 10 µl | 20% |
| Saliva | 10 µl | 20% |
Control de calidad
1. Detección de funciones: sensibilidad, especificidad y repetibilidad de qPCR.
2. Sin actividad de nucleasa exógena: sin endonucleasa exógena ni contaminación por exonucleasa.
Notas del producto
1. Este producto emplea un nuevo tipo de ADN polimerasa de arranque en caliente, que se puede activar en 1 a 5 minutos. Dado que su tampón de reacción ha sido optimizado, es más adecuado para PCR cuantitativa de fluorescencia doble o múltiple utilizando el método de sonda.
2. Si el valor Rn de la amplificación por PCR es demasiado bajo o la amplificación está obviamente inhibida, disminuir la cantidad de muestra, aumentar el volumen de reacción o diluir previamente la muestra puede mejorar los resultados.
3. La recolección de sangre, saliva, orina, hisopos de garganta, etc. debe seguir los requisitos de los criterios clínicos y se pueden utilizar muestras frescas para evitar la degradación del ácido nucleico.
4. Dado que diferentes amplicones tienen diferente eficiencia de utilización de dUTP y sensibilidad a UNG, los reactivos deben optimizarse si la sensibilidad de detección disminuye cuando se utiliza el sistema UNG.Por favor contáctenos para soporte técnico si es necesario.
5. Para evitar la amplificación de productos de PCR remanentes entre reacciones de un solo paso, se requiere un área experimental dedicada y una pipeta para la amplificación.Opere con guantes y cámbielos con frecuencia y no abra el tubo de reacción después de la amplificación por PCR.
