Proteinasa K NGS (polvo)
Número de gato: HC4507A
NGS Protease K es una serina proteasa estable con alta actividad enzimática y amplia especificidad de sustrato. La enzima descompone preferentemente enlaces éster y enlaces peptídicos adyacentes al C-terminal de aminoácidos hidrofóbicos, aminoácidos que contienen azufre y aminoácidos aromáticos.Por lo tanto, se utiliza a menudo para degradar proteínas en péptidos cortos.NGS Protease K es una serina proteasa típica con Asp39-Su69-Ser224tríada catalítica que es exclusiva de las serina proteasas, y el centro catalítico está rodeado por dos Ca2+sitios de unión para la estabilización, manteniendo una alta actividad enzimática en una gama más amplia de condiciones.
Especificación
| Apariencia | Polvo amorfo de color blanco a blanquecino, liofilizado |
| Actividad específica | ≥40U/mg sólido |
| ADNasa | Ninguno detectado |
| ARNasa | Ninguno detectado |
| Carga biológica | ≤50 UFC/g sólido |
| Residuo de ácido nucleico | <5pg/mg sólido |
Propiedades
| Fuente | Álbum de tritiraquio |
| número CE | 3.4.21.64(Recombinante del álbum Tritirachium) |
| Peso molecular | 29 kDa (PÁGINA SDS) |
| Punto isoeléctrico | 7.81 Figura 1 |
| pH óptimo | 7,0-12,0 (Todos realizan una actividad elevada) Fig.2 |
| Temperatura óptima | 65℃ Fig.3 |
| Estabilidad del pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Fig.4 |
| Estabilidad térmica | Por debajo de 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig.5 |
| Estabilidad de almacenamiento | Almacenado a 25 ℃ durante 12 meses Fig.6 |
| Activadores | SDS, urea |
| Inhibidores | Fluorofosfato de diisopropilo;fluoruro de bencilsulfonilo |
Condiciones de almacenaje
Guarde el polvo liofilizado a -25~-15 ℃ durante mucho tiempo, protegido de la luz;Después de la disolución, coloque alícuotas en el volumen adecuado para el almacenamiento a corto plazo a 2-8 ℃ protegido de la luz o para almacenamiento a largo plazo a -25 ~ -15 ℃ protegido de la luz.
Precauciones
Use guantes y gafas protectoras cuando lo use o pese, y manténgalo bien ventilado después de su uso.Este producto puede causar reacciones alérgicas en la piel e irritación ocular grave.Si se inhala, puede provocar síntomas de alergia o asma o disnea.Puede causar irritación respiratoria.
Definición de unidad
Una unidad de NGS proteasa K se define como la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar la caseína en 1 μmol de L-tirosina en condiciones de determinación estándar.
Preparación de reactivos
| Reactivo | Fabricante | Catalogar |
| caseína técnicade leche bovina | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Química SinopharmReactivo Co., Ltd. | 10019762 |
| nah2PO4·2H2O | Química SinopharmReactivo Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Química SinopharmReactivo Co., Ltd. | 20040618 |
| Ácido tricloroacético | Química SinopharmReactivo Co., Ltd. | 80132618 |
| Acetato de sodio | Química SinopharmReactivo Co., Ltd. | 10018818 |
| Ácido acético | Química SinopharmReactivo Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Química SinopharmReactivo Co., Ltd. | 10011018 |
| carbonato de sodio | Química SinopharmReactivo Co., Ltd. | 10019260 |
| folina-fenol | Sangon Biotech (Shanghái)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirosina | Sigma | 93829 |
Reactivo I:
Sustrato: Solución de caseína de leche bovina al 1%: disolver 1 g de caseína de leche bovina en 50 ml de solución de fosfato de sodio 0,1 M, pH 8,0, calentar al baño maría a 65-70 °C durante 15 minutos, agitar y disolver, enfriar con agua, ajustar con hidróxido de sodio hasta pH 8,0 y diluir en 100 ml.
Reactivo II:
Solución de TCA: ácido tricloroacético 0,1 M, acetato de sodio 0,2 M y ácido acético 0,3 M (pesar 1,64 g de ácido tricloroacético + 1,64 g de acetato de sodio + 1,724 ml de ácido acético sucesivamente, añadir 50 ml de agua desionizada, ajustar con HCl a pH 4,03 y diluir en 100ml).
Reactivo III:
0,4 ml de solución de carbonato de sodio (pesar 4,24 g de carbonato de sodio anhidro y disolver en 100 ml de agua)
Reactivo IV:
Reactivo folin fenol: diluir 5 veces con agua desionizada.
Reactivo V:
Diluyente enzimático: solución de fosfato de sodio 0,1 M, pH 8,0.
Reactivo VI:
Solución estándar de L-tirosina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml de L-tirosina disuelta con HCl 0,2 M.
Procedimiento
1. Encienda el espectrofotómetro UV-Vis y seleccione la medición fotométrica.
2. Establezca la longitud de onda en 660 nm.
3. Encienda el baño de agua, ajuste la temperatura a 37 ℃ y asegúrese de que la temperatura no cambie durante 3-5 minutos.
4. Precaliente 0,5 ml de sustrato en un tubo de centrífuga de 2 ml en un baño de agua a 37 ℃ durante 10 minutos.
5. Extraiga 0,5 ml de solución de enzima diluida en el tubo de centrífuga precalentado durante 10 minutos.Establezca el diluyente de enzimas como grupo en blanco.
6. Agregue 1,0 ml de reactivo TCA inmediatamente después de la reacción.Mezclar bien e incubar en baño maría durante 30 minutos.
7. Centrifugar la solución de reacción.
8. Agregue los siguientes componentes en el orden especificado.
| Reactivo | Volumen |
| Flotante | 0,5 ml |
| carbonato de sodio 0,4 M | 2,5 ml |
| Reactivo folin fenol | 0,5 ml |
9. Mezcle bien antes de incubar en un baño de agua a 37 ℃ durante 30 minutos.
10. sobredosis660se determinó como OD1;grupo de control en blanco: el diluyente enzimático se utiliza para reemplazar la solución enzimática para determinar la DO660como OD2, ΔOD=OD1-SOBREDOSIS2.
11. Curva estándar de L-tirosina: 0,5 ml de solución de L-tirosina de diferente concentración, 2,5 ml de carbonato de sodio 0,4 M, 0,5 ml de reactivo de folin fenol en un tubo de centrífuga de 5 ml, incubar a 37 ℃ durante 30 minutos, detectar OD660para diferentes concentraciones de L-tirosina, luego se obtuvo la curva estándar Y=kX+b, donde Y es la concentración de L-tirosina, X es OD600.
Cálculo
2: Volumen total de solución de reacción (mL)
0,5: Volumen de solución enzimática (mL)
0,5: Volumen del líquido de reacción utilizado en la determinación cromogénica (mL)
10: tiempo de reacción (min)
Df: Dilución múltiple
C: Concentración de enzima (mg/mL)
Cifras
Fig.1 residuo de ADN
| Muestra | Cra C4 | Ácido nucleico Recuperación (pg/mg) | Recuperación(%) | Nucleico total ácido ( pg/mg) |
| PRK | 24,66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+ETS2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| ETS1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| ETS2 | 16 | |||
| ETS3 | 19.125 | |||
| ETS4 | 23.135 | |||
| ETS5 | 26.625 | |||
| H2O libre de ARN | Indeterminado | — | — | — |
Fig.2 pH óptimo
Fig.3 Temperatura óptima
Fig.4 Estabilidad del pH
Fig.5 Estabilidad térmica
Fig.6 Estabilidad de almacenamiento a 25 ℃
