Uracilo ADN glicosilasa
La uracil-ADN glicosilasa (UNG o UDG) es un clon recombinante de E. coli con un peso molecular de 25 kDa.Cataliza la liberación de uracilo libre a partir de ADN monocatenario y bicatenario que contiene uracilo, es inactivo contra el ARN y puede usarse para prevenir la contaminación de los productos de amplificación por PCR.El principio de acción se basa en el hecho de que si en la reacción de PCR se sustituye dUTP por dTTP y se forma un producto de amplificación de PCR que contiene bases dU, la enzima puede romper selectivamente el enlace glicosídico de las bases U en moléculas monocatenarias y bicatenarias. ADN y degradar el producto de amplificación por PCR.
Aplicación recomendada
Amplificación de la prevención de la contaminación
Condición de almacenamiento
-20°C para almacenamiento a largo plazo, se debe mezclar bien antes de su uso, evitar la congelación y descongelación frecuente.
Búfer de almacenamiento
Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, estabilizador, glicerol al 50 %.
Definición de unidad
La cantidad de enzima necesaria para degradar 1 µg de ADN monocatenario que contiene bases dU en 1 hora a 37°C es 1 unidad.
Control de calidad
1.Pureza electroforética SDS-PAGE superior al 98%
2.Sensibilidad de amplificación, control de lote a lote, estabilidad
3.Después de tratar 1U de UNG a 50 ℃ durante 2 minutos, la plantilla que contiene U por debajo de 103 copias debe degradarse por completo y no se puede producir ningún producto de amplificación.
4.Sin actividad nucleasa exógena
Instrucciones
| Componentes | Volumen (μL) | Concentración final |
| 10 × tampón de PCR (sin dNTP, Mg²+gratis) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 µM |
| dUTP (reemplazar dTTP) | - | 200-600 µM |
| MgCl 25 mM2 | 2-8 µL | 1-4 mm |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 unidades |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × mezcla de imprimacióna | 2 | 1× |
| Plantilla | - | <1μg/reacción |
| ddH₂O | hasta 50 | - |
Nota: a: Si se utiliza para qPCR/qRT-PCR, la sonda fluorescente debe agregarse al sistema de reacción.Normalmente, una concentración final de cebador de 0,2 µM puede dar buenos resultados;cuando el rendimiento de la reacción es deficiente, la concentración del cebador se puede ajustar en el intervalo de 0,2 a 1 µM.Normalmente, la concentración de la sonda se optimiza en el rango de 0,1 a 0,3 µM.Se pueden realizar experimentos de gradiente de concentración para encontrar la mejor combinación de cebador y sonda.
Notas
1.La enzima UNG se puede utilizar para eliminar los productos de amplificación de dUTP contaminados del sistema de reacción antes de la reacción de amplificación por PCR y luego para evitar resultados falsos positivos debido a la contaminación del producto.
2.La temperatura óptima para que se utilice la enzima UNG en la reacción de PCR anticontaminación es generalmente de 50 ℃ durante 2 minutos;la condición de inactivación es 95 ℃ durante 5 minutos.
3.Evite las frecuentes heladas y descongelaciones y no lo exponga a grandes fluctuaciones de temperatura.
4.Los diferentes genes que se van a amplificar tienen diferente eficiencia de utilización de dUTP y sensibilidad a la enzima UNG, por lo tanto, si el uso del sistema UNG conduce a una disminución en la sensibilidad de detección, el sistema de reacción debe ajustarse y optimizarse; si necesita soporte técnico, comuníquese con nuestra compañía.
