Proteinasa K mNGS (líquido)
La proteinasa K es una serina proteasa estable con amplia especificidad de sustrato.Degrada muchas proteínas en estado nativo incluso en presencia de detergentes.La evidencia de estudios de estructura cristalina y molecular indica que la enzima pertenece a la familia de las subtilisinas con una tríada catalítica de sitio activo (Asp39-Su69-Ser224).El sitio predominante de escisión es el enlace peptídico adyacente al grupo carboxilo de aminoácidos alifáticos y aromáticos con grupos alfa amino bloqueados.Se utiliza comúnmente por su amplia especificidad.Esta proteinasa K está especialmente diseñada para mNGS.En comparación con la otra proteinasa K, contiene incluso menos contaminación de ácido nucleico con el mismo rendimiento enzimático, lo que podría garantizar mejor la aplicación posterior de mNGS.
Condiciones de almacenaje
2-8 ℃ durante 2 años
Especificación
| Apariencia | Líquido de incoloro a marrón claro. |
| Actividad | ≥800 U/ml |
| Concentración de proteínas | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Ninguno detectado |
| ADNasa | Ninguno detectado |
| ARNasa | Ninguno detectado |
Propiedades
| número CE | 3.4.21.64(Recombinante del álbum Tritirachium) |
| Punto isoeléctrico | 7,81 |
| pH óptimo | 7,0- 12,0 Figura 1 |
| Temperatura óptima | 65 ℃ Figura 2 |
| estabilidad del pH | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 h) Fig. 3 |
| Estabilidad térmica | Por debajo de 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig. 4 |
| Estabilidad de almacenamiento | Más del 90 % de actividad durante 12 meses a 25 ℃ |
| Activadores | SDS, urea |
| Inhibidores | Fluorofosfato de diisopropilo;fluoruro de fenilmetilsulfonilo |
Aplicaciones
1. Kit de diagnóstico genético
2. Kits de extracción de ARN y ADN
3. Extracción de componentes no proteicos de los tejidos, degradación de impurezas proteicas, como el ADN.Vacunas y preparación de heparina.
4. Preparación de ADN cromosómico mediante electroforesis pulsada.
5. Transferencia occidental
6. Reactivos enzimáticos de albúmina glicosilada diagnóstico in vitro
Precauciones
Use guantes y gafas protectoras cuando lo use o pese, y manténgalo bien ventilado después de su uso.Este producto puede causar reacciones alérgicas en la piel e irritación ocular grave.Si se inhala, puede provocar síntomas de alergia o asma o disnea.Puede causar irritación respiratoria.
Definición de unidad
Una unidad (U) se define como la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar la caseína y producir 1 μmol.tirosina por minuto bajo las siguientes condiciones.
Preparación de reactivos
Reactivo I: Se disolvió 1 g de caseína de leche en 50 ml de solución de fosfato de sodio 0,1 M (pH 8,0), se incubó en agua a 65-70 ℃ durante 15 minutos, se agitó y se disolvió, se enfrió con agua, se ajustó con hidróxido de sodio a pH 8,0 y se fijó el volumen. 100ml.
Reactivo II: ácido tricloroacético 0,1 M, acetato de sodio 0,2 M, ácido acético 0,3 M.
Reactivo III: Na 0,4 M2CO3solución.
Reactivo IV: Reactivo de Forint diluido con agua pura 5 veces.
Reactivo V: Diluyente enzimático: solución de fosfato de sodio 0,1 M (pH 8,0).
Reactivo VI: solución de tirosina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml de tirosina disuelta con 0,2HCl M.
Procedimiento
1. Se precalientan 0,5 ml de reactivo I a 37 ℃, se añaden 0,5 ml de solución enzimática, se mezclan bien y se incuban a37 ℃ durante 10 minutos.
2. Agregue 1 ml de reactivo II para detener la reacción, mezcle bien y continúe la incubación durante 30 minutos.
3. Centrifugar la solución de reacción.
4. Tome 0,5 ml de sobrenadante, agregue 2,5 ml de reactivo III, 0,5 ml de reactivo IV, mezcle bien e incube a 37 ℃durante 30 minutos.
5. sobredosis660se determinó como OD1;grupo de control en blanco: se utilizan 0,5 ml de reactivo V para reemplazar la enzimasolución para determinar OD660como OD2, ΔOD=OD1-SOBREDOSIS2.
6. Curva estándar de L-tirosina: 0,5 ml de solución de L-tirosina de diferente concentración, 2,5 ml de reactivo III, 0,5 ml de reactivo IV en un tubo de centrífuga de 5 ml, incubar a 37 ℃ durante 30 minutos, detectar la DO660para diferentes concentraciones de L-tirosina, luego se obtuvo la curva estándar Y=kX+b, donde Y es la concentración de L-tirosina, X es OD600.
Cálculo
2: Volumen total de solución de reacción (mL)
0,5: Volumen de solución enzimática (mL)
0,5: Volumen del líquido de reacción utilizado en la determinación cromogénica (mL)
10: tiempo de reacción (min)
Df: Dilución múltiple
C: Concentración de enzima (mg/mL)
Referencias
1. Wieger U y Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U y Hilz H. Biochem.Biofísica.Res.Comunitario.(1971);44:513.
3. Hilz, H.y otros,EUR.J. Bioquímica.(1975);56:103–108.
4. Sambrook J.et Alabama., Clonación molecular: manual de laboratorio, segunda edición, Cold Spring HarborPrensa de laboratorio, Cold Spring Harbor (1989).
Cifras
Higo.1 Óptimo pH
Solución tampón 100 mM: pH 6,0-8,0, fosfato sódico;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH 9,0-12,5, glicina-NaOH. Concentración de enzima: 1 mg/ml
Fig.2 Temperatura óptima
Reacción en tampón K-fosfato 20 mM, pH 8,0.Concentración de enzima: 1 mg/mL
Fig.3 pH Estabilidad
25 ℃, tratamiento de 16 h con solución tampón 50 mM: pH 4,5-5,5, acetato;pH 6,0-8,0, fosfato sódico;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0- 12,5, Glicina-NaOH.Concentración de enzima: 1 mg/mL
Fig.4 Térmica estabilidad
Tratamiento de 30 minutos con tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8,0.Concentración de enzima: 1 mg/mL
Fig.5 Almacenamiento establety at 25 ℃
