Transcriptasa inversa RTL
La transcriptasa inversa RTL es una ADN polimerasa dependiente de plantilla de ARN que carece de actividad exonucleasa 3'→5' y tiene actividad ARNasa H.Esta enzima puede utilizar ARN como plantilla para sintetizar una hebra complementaria de ADN, que puede aplicarse a la síntesis de ADNc de primera hebra, especialmente para RT-LAMP (amplificación isotérmica mediada por bucle).En comparación con la transcriptasa inversa RTL 1.0, la sensibilidad mejora significativamente, la estabilidad térmica es más fuerte y la reacción a 65 °C es más estable.La transcriptasa inversa RTL (sin glicerol) se puede utilizar para preparar preparaciones liofilizadas, reactivos RT-LAMP liofilizados, etc.
Definición de unidad
Una unidad incorpora 1 nmol de dTTP en material precipitable con ácido en 20 minutos a 50°C utilizando poli(A)·oligo(dT)25 como plantilla-cebador.
Componentes
| Componente | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| Transcriptasa inversa RTL (sin glicerol) (15U/μL) | 0,1 mililitros | 1 mililitro | 10ml |
| Tampón RTL 10×HC | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10ml |
| MgSO4 (100 mm) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10ml |
Condición de almacenamiento
Transporte por debajo de 0 °C y almacenamiento entre -25 °C y -15 °C.
Control de calidad
- Actividad residual deEendonucleasa:Una reacción de 50 μL que contiene 1 μg de λDNA y 15 unidades de RTL2.0 incubadas durante 16 horas a 37 ℃ muestra el mismo patrón que el control negativo mediante electroforesis en gel.
- Actividad residual deexonucleasa:Una reacción de 50 μl que contiene 1 μg de ADN λ digerido con Hind Ⅲ y 15 unidades de RTL2.0 incubadas durante 16 horas a 37 ℃ muestra el mismo patrón que el control negativo mediante electroforesis en gel.
- Actividad residual deNickase:Una reacción de 50 µl que contiene 1 µg de pBR322 superenrollado y 15 unidades de RTL2.0 incubadas durante 4 horas a 37°C muestra el mismo patrón que el control negativo mediante electroforesis en gel.
- Actividad residual deARNasa:Una reacción de 10 µl que contiene 0,48 µg de ARN de MS2 y 15 unidades de RTL2.0 incubadas durante 4 horas a 37 °C muestra el mismo patrón que el control negativo mediante electroforesis en gel.
- E. coli gADN:Medido conE. colikits de detección de HCD específicos, 15 unidades de RTL2.0 contienen menos de 1E. coligenoma.
Configuración de reacción
Protocolo de síntesis de ADNc
| Componentes | Volumen |
| Plantilla de ARN a | opcional |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) o mezcla de cebador aleatorio (60uM) | 2 µL |
| Mezcla dNTP (10 mm cada una) | 1 µL |
| Inhibidor de ARNasa (40U/uL) | 0,5 µL |
| Transcriptasa inversa RTL 2.0 (15U/uL) | 0,5 µL |
| Tampón RTL 10×HC | 2 µL |
| Agua libre de nucleasas | Hasta 20 µL |
Notas:
1) La dosis recomendada de ARN total es 1 ng ~ 1 μg
2) La dosis recomendada de ARNm fue de 50 ng ~ 100 ng
Termo-ciclismo Condiciones para una rutina reacción:
| Temperatura (°C) | Tiempo |
| 25ºCa | 5 minutos |
| 55ºC | 10 minutosb |
| 80 ºC | 10 minutos |
Notas:
1) Si se utiliza Random Primer Mix, un paso de incubación a 25 °C.
2) Si se utiliza la mezcla de cebadores objetivo, un paso de incubación a 55 °C durante 10 a 30 minutos.
Protocolo RT-LAMP
| Componentes | Volumen | Concentración final |
| Plantilla de ARN | opcional | ≥10 copias |
| Mezcla dNTP (10 mm) | 3,5 µL | 1,4 mm |
| Imprimadores FIP/BIP (25×) | 1 µL | 1,6 µM |
| Imprimaciones F3/B3 (25×) | 1 µL | 0,2 µM |
| Cebadores LoopF/LoopB (25×) | 1 µL | 0,4 µM |
| Inhibidor de RNasa (40U/μL) | 0,5 µL | 20 U/Reacción |
| Transcriptasa inversa RTL 2.0 (15U/μL) | 0,5 µL | 7,5 U/Reacción |
| ADN polimerasa Bst V2 (8U/μL) | 1 µL | 8 U/Reacción |
| MgSO4 (100 mm) | 1,5 µL | 6 mm (8 mm en total) |
| Tampón 10×HC RTL (o búfer 10×HC Bst V2) | 2,5 µL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Agua libre de nucleasas | Hasta 25 µL | - |
Notas:
1) Mezcle mediante vórtex y centrifugue brevemente para recolectar.Incubación a temperatura constante a 65°C durante 1 hora.
2) Los dos buffers son interoperables y tienen la misma composición.
Notas
1.Este producto formará un sólido blanco cuando se almacene a -20 °C.Sácalo de -20°C y ponlo en hielo durante unos 10 minutos.Después de derretirse, se puede utilizar agitando y mezclando.
2.El producto de ADNc podría almacenarse a -20 °C o -80 °C o usarse inmediatamente para la reacción de PCR.
3. Para evitar la contaminación por ARNasa, mantenga limpia el área experimental y use guantes y máscaras limpios durante la operación.
