Premezcla universal SYBR GREEN qPCR (azul)
Número de gato: HCB5041B
Universal Blue qPCR Master Mix (base de tinte) es una solución previa para la amplificación por PCR cuantitativa en tiempo real 2x caracterizada por una alta sensibilidad y especificidad, es de color azul y tiene el efecto de seguimiento de la adición de muestras.El componente central Taq ADN polimerasa utiliza un inicio en caliente de anticuerpos para inhibir eficazmente la amplificación no específica debido al recocido de cebadores durante la preparación de la muestra.Al mismo tiempo, la fórmula agrega factores promotores para mejorar la eficiencia de amplificación de la reacción de PCR e igualar la amplificación de genes con diferentes contenidos de GC (30 ~ 70%), de modo que la PCR cuantitativa pueda obtener una buena relación lineal en una amplia gama cuantitativa. región.Este producto contiene un tinte de referencia pasivo ROX especial, que es aplicable a la mayoría de los instrumentos qPCR.No es necesario ajustar la concentración de ROX en diferentes instrumentos.Sólo es necesario agregar cebadores y plantillas para preparar el sistema de reacción para la amplificación.
Componentes
Mezcla maestra de qPCR azul universal
Condiciones de almacenaje
El producto se envía con bolsas de hielo y se puede almacenar a -25 ℃ ~ -15 ℃ durante 18 meses.Es necesario evitar una fuerte irradiación de luz al almacenar o preparar el sistema de reacción.
Especificación
| Concentración | 2× |
| Método de detección | SIBR |
| método de PCR | qPCR |
| polimerasa | Taq ADN polimerasa |
| tipo de muestra | ADN |
| Equipo de aplicación | La mayoría de los instrumentos qPCR |
| Tipo de producto | Premezcla SYBR para PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real |
| Aplicar a (solicitud) | La expresion genica |
Instrucciones
1.Sistema de reacción
| Componentes | Volumen (μL） | Volumen (μL） | Concentración final |
| Premezcla qPCR universal SYBR GREEN | 25 | 10 | 1× |
| Imprimación directa (10 μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2μmol/L |
| Imprimador inverso (10 μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2μmol/L |
| ADN | X | X | |
| ddH2O | hasta 50 | hasta 20 | - |
[Nota]: Mezcle bien antes de usar para evitar burbujas excesivas al agitar vigorosamente.
a) Concentración del cebador: La concentración final del cebador es de 0,2 μmol/L, y también se puede ajustar entre 0,1 y 1,0 μmol/L según corresponda.
b) Concentración de la plantilla: si la plantilla es una solución madre de ADNc sin diluir, el volumen utilizado no debe exceder 1/10 del volumen total de la reacción de qPCR.
c) Dilución de la plantilla: se recomienda diluir la solución madre de ADNc de 5 a 10 veces.La cantidad óptima de plantilla añadida es mejor cuando el valor de Ct obtenido por amplificación es de 20 a 30 ciclos.
d) Sistema de reacción: se recomienda utilizar 20 μL o 50 μL para garantizar la efectividad y repetibilidad de la amplificación del gen objetivo.
e) Preparación del sistema: prepárelo en el banco súper limpio y use las puntas y los tubos de reacción sin residuos de nucleasa;Se recomienda utilizar las puntas con cartuchos filtrantes.Evite la contaminación cruzada y la contaminación por aerosoles.
2.Programa de reacción
Programa estándar
| Paso del ciclo | Temperatura. | Tiempo | Ciclos |
| Desnaturalización inicial | 95 ℃ | 2 minutos | 1 |
| Desnaturalización | 95 ℃ | 10 seg | 40 |
| Recocido/Extensión | 60℃ | 30 segundos ★ | |
| Etapa de la curva de fusión | Valores predeterminados del instrumento | 1 | |
Programa rápido
| Paso del ciclo | Temperatura. | Tiempo | Ciclos |
| Desnaturalización inicial | 95 ℃ | 30 segundos | 1 |
| Desnaturalización | 95 ℃ | 3 seg | 40 |
| Recocido/Extensión | 60℃ | 20 segundos ★ | |
| Etapa de la curva de fusión | Valores predeterminados del instrumento | 1 | |
[Nota]: El programa rápido es adecuado para la gran mayoría de genes, y se pueden probar programas estándar para genes de estructura secundaria complejos individuales.
a) Temperatura y tiempo de hibridación: ajuste según la longitud del cebador y el gen objetivo.
b) Adquisición de señal de fluorescencia (★): Configure el procedimiento experimental de acuerdo con los requisitos de las instrucciones de uso del instrumento.
c) Curva de fusión: el programa predeterminado del instrumento se puede utilizar normalmente.
3. Análisis de resultados
Se requirieron un mínimo de tres réplicas biológicas para experimentos cuantitativos.Después de la reacción, es necesario confirmar la curva de amplificación y la curva de fusión.
3.1 Curva de amplificación:
La curva de amplificación estándar tiene forma de S.El análisis cuantitativo es más preciso cuando el valor de Ct está entre 20 y 30. Si el valor de Ct es inferior a 10, es necesario diluir la plantilla y realizar la prueba nuevamente.Cuando el valor de Ct está entre 30 y 35, es necesario aumentar la concentración de la plantilla o el volumen del sistema de reacción, para mejorar la eficiencia de la amplificación y garantizar la precisión del análisis de los resultados.Cuando el valor de Ct es superior a 35, los resultados de la prueba no pueden analizar cuantitativamente la expresión del gen, pero pueden usarse para análisis cualitativos.
3.2 Curva de fusión:
El único pico de la curva de fusión indica que la especificidad de la reacción es buena y se puede realizar un análisis cuantitativo;Si la curva de fusión muestra picos dobles o múltiples, no se puede realizar el análisis cuantitativo.La curva de fusión muestra picos dobles y es necesario juzgar si el pico no objetivo es un dímero de cebador o una amplificación no específica mediante electroforesis en gel de agarosa de ADN.Si se trata de un dímero de cebador, se recomienda reducir la concentración del cebador o rediseñar los cebadores con alta eficiencia de amplificación.Si se trata de una amplificación no específica, aumente la temperatura de hibridación o rediseñe los cebadores con especificidad.
Notas
¡Use el EPP necesario, como bata de laboratorio y guantes, para garantizar su salud y seguridad!
¡Este producto es SÓLO para uso en investigación!
