ADN polimerasa salvaje Taq
La ADN polimerasa Taq es una ADN polimerasa termoestable de Thermus Aquaticus YT-1, que posee una actividad polimerasa 5′→3′ y una actividad endonucleasa flap 5′.
Componentes
| Componente | HC1010A-01 | HC1010A-02 | HC1010A-03 | HC1010A-04 |
| búfer Taq 10× | 2×1mL | 2×10ml | 2×50ml | 5×200ml |
| Taq ADN polimerasa (5 U/μL) | 0,1 mililitros | 1 mililitro | 5ml | 5×10ml |
Condición de almacenamiento
Transporte por debajo de 0 °C y almacenamiento entre -25 °C y -15 °C.
Definición de unidad
Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorpora 15 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 75°C.
Control de calidad
1.Ensayo de pureza de proteínas (SDS-PAGE):La pureza de la ADN polimerasa Taq fue ≥95 % determinada mediante análisis SDS-PAGE.
2.EndActividad de la onucleasa:Un mínimo de 5 U de Taq ADN polimerasa con 1 μg de λDNA durante 16 horas a 37 ℃ no produce degradación detectable según lo determinado.
3.Actividad exonucleasa:Un mínimo de 5 U de ADN polimerasa Taq con 1 μg de ADN digerido con λ -Hind Ⅲ durante 16 horas a 37 ℃ no produce degradación detectable según lo determinado.
4.Actividad de Nickase:Un mínimo de 5 U de ADN polimerasa Taq con 1 μg de ADN pBR322 durante 16 horas a 37 °C no produce degradación detectable según lo determinado.
5.Actividad de la ARNasa:Un mínimo de 5 U de ADN polimerasa Taq con 1,6 μg de ARN MS2 durante 16 horas a 37 °C no produce degradación detectable según lo determinado.
6.E. coliADN:Se analizan 5 U de ADN polimerasa Taq para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli utilizando TaqMan qPCR con cebadores específicos para el locus de ARNr 16S de E. coli.La contaminación del ADN genómico de E. coli es ≤1 copia.
7.Amplificación por PCR (ADN Lambda de 5,0 kb)- Una reacción de 50 µl que contiene 5 ng de ADN Lambda con 5 unidades de ADN polimerasa Taq durante 25 ciclos de amplificación por PCR da como resultado el producto esperado de 5,0 kb.
Configuración de reacción
| Componentes | Volumen |
| Plantilla de ADNa | opcional |
| Cebador directo de 10 μM | 1 µL |
| Cebador inverso de 10 μM | 1 µL |
| Mezcla dNTP (10 mm cada una) | 1 µL |
| búfer Taq 10× | 5 µl |
| ADN polimerasa Taqb | 0,25 µL |
| Agua libre de nucleasas | Hasta 50 µL |
Notas:
1) La concentración de reacción óptima de diferentes plantillas es diferente.La siguiente tabla muestra el uso de plantilla recomendado para un sistema de reacción de 50 µL.
| ADN | Cantidad |
| genómico | 1 ng-1 μg |
| Plásmido o viral | 1 pg-1 ng |
2) La concentración óptima de Taq ADN polimerasa puede oscilar entre 0,25 µL y 1 µL en aplicaciones especializadas.
ReacciónPrograma
| Paso | Temperatura(°C) | Tiempo | Ciclos |
| Desnaturalización iniciala | 95℃ | 5 minutos | - |
| Desnaturalización | 95℃ | 15-30 segundos | 30-35 ciclos |
| Recocidob | 60℃ | 15 segundos | |
| Extensión | 72℃ | 1kb/min | |
| Ampliación definitiva | 72℃ | 5 minutos | - |
Notas:
1) La condición de desnaturalización inicial es adecuada para la mayoría de las reacciones de amplificación y puede modificarse según la complejidad de la estructura de la plantilla.Si la estructura de la plantilla es compleja, el tiempo de predesnaturalización se puede ampliar a 5 – 10 minutos para mejorar el efecto de desnaturalización inicial.
2) La temperatura de recocido debe ajustarse de acuerdo con el valor de Tm del cebador, que generalmente se establece entre 3 y 5 ℃ por debajo del valor de Tm del cebador;Para plantillas complejas, es necesario ajustar la temperatura de recocido y extender el tiempo de extensión para lograr una amplificación eficiente.
